Telah dua tahun berlalu sejak Peter Parker berubah menjadi pahlawan pembela kebenaran Spider-man. Banyak hal yang telah berubah, salah satunya menyangkut gadis yang disukainya Mary Jane Watson. Kini, MJ adalah seorang bintang teater dan model terkenal yang wajahnya terpampang di mana-mana.

Sayang, keberuntungan nampaknya tidak pernah berpihak pada Peter. Ia tidak pernah bertahan lama di satu pekerjaan karena selalu terlambat akibat kegiatannya sebagai Spider-man. Kuliahnya pun nyaris terbengkalai sehingga dosennya Doc Connors memberi peringatan keras. Yang paling parah, sahabat dekatnya Harry Osborn mulai membencinya karena dianggap menutupi rahasia siapa sebenarnya Spider-man, pria yang membunuh ayahnya.

Keadaan semakin rumit saat ia bertemu dengan seorang ilmuwan jenius bernama Otto Octavius, pria yang berusaha menemukan cara untuk membuat kehidupan manusia menjadi lebih baik namun sebuah kecelakaan malah mengubahnya menjadi psikopat. Akibat empat tentakel robot yang menempel secara permanen pada dirinya, pers menyebutnya sebagai Doctor Octopus.

Peter sendiri mulai muak dengan kehidupan sebagai Spider-man yang membuatnya tidak dapat memperoleh apa yang diinginkannya, terutama setelah mengetahui MJ berencana menikah dengan seorang pria astronot yang ternyata putra bosnya J. Jonah Jameson.

Setelah kekuatannya mulai menghilang, Peter memutuskan untuk berhenti menjadi Spider-man dan mulai mengejar apa yang diinginkannya, salah satunya adalah cinta MJ. Namun niat tersebut mendapat berbagai halangan. Doc Ock yang ingin meneruskan eksperimen gilanya berusaha mencari benda langka tritium yang hanya bisa diperoleh dari OsCorp, dan Harry dengan cerdik memintanya barter dengan sosok Spiderman dalam keadaan hidup.

Dalam waktu singkat, terjadi pertempuran besar-besaran yang melibatkan adegan aksi di kereta api yang sedang melaju. Peter kembali menjadi Spider-man demi menyelamatkan kota namun ia berhasil ditawan Doc Ock. Akankah Harry mengetahui siapa Spider-man sesungguhnya?

Sekuel keduanya ini telah ditunggu karena menghadirkan pertarungan yang jauh lebih dahsyat dibanding seri pertama. Tidak hanya itu, sutradara Sam Raimi juga memberikan sentuhan kemanusiaan dimana tokoh Peter Parker mengalami dilema antara tugas superhero yang diembannya dengan keinginannya sebagai manusia biasa.

Sama seperti sebelumnya, Peter Parker diperankan oleh Tobey Maguire, Mary Jane Watson oleh Kirsten Dunst, Rosemary Harris sebagai May Parker, James Franco sebagai Harry Osborn, dan JK Simmons memerankan Jonah Jameson. Stu-satunya tokoh utama baru yang muncul adalah Alfred Molina si Doctor Octopus.